Fluorescenčné mikroskopia: princíp metódy

Absorpcia a opätovné emisie svetla ďalších anorganických a organických kvapalín je výsledkom fosforeskujúci alebo fluorescencie. Rozdiel medzi javmi je doba trvania intervalu medzi absorpcie a emisie svetelného toku. Ak dôjde k fluorescencie týchto procesov takmer súčasne, zatiaľ čo fosforescencia - s určitým oneskorením.

historické informácie

V roku 1852, britský vedec Stokes, prvýkrát popísaná fluorescencie. On predstavil nový termín ako výsledok experimentov s kazivca, ktoré emitujú červené svetlo pod ultrafialovým svetlom. Stokes zaznamenali zaujímavý jav. Bolo zistené, že vlnová dĺžka fluorescenčného žiarenia je vždy väčší ako prietok excitačného svetla.

Pre potvrdenie hypotézy v 19. storočí tam bolo veľa pokusov. Tie ukázali, že rôzne vzorky fluoreskujú pod vplyvom ultrafialového svetla. Medzi materiály, okrem iného, boli kryštály, živice, minerálne látky, chlorofyl, surové drogy, anorganické zlúčeniny, vitamíny, oleje. Priame použitie farbív pre biologické testy začali až v roku 1930,

Fluorescenčné mikroskopia: Popis

Niektoré z materiálov použitých v prvej polovici štúdií 20. storočia vykazovali vysokú špecifickosť. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Vďaka výkonu, ktorý nemôže byť dosiahnutý pomocou kontrastnej metódy, spôsob fluorescenčné mikroskopia sa stala základným nástrojom v oblasti biomedicíny a biologického výskumu. Rovnako tak boli získané významné výsledky, a pre materiály.

? Aké výhody spôsob fluorescenčné mikroskopie? Použitie nových materiálov sa stalo možné a výber vysoko špecifických buniek submikroskopické komponenty. Fluorescenčné mikroskopia môže detekovať jednotlivé molekuly. Paleta farieb umožnilo určiť viac položiek naraz. Aj napriek obmedzenej priestorové rozlíšenie limitu difrakčné zariadení, ktorá zase závisí od špecifických vlastností vzorky, identifikácia molekúl pod túto hodnotu, je tiež celkom možné. Rôzne vzorky po ožiarení výstavnej autofluorescence. Tento jav je široko používaný v petrológia, botaniky, v polovodičovom priemysle.

rysy

Študovať zvieracích tkanív alebo patogény často komplikované alebo príliš slabé alebo veľmi silné nešpecifické autofluorescence. Avšak hodnota v štúdiách získava úvod do materiálových komponentov vybuzených na špecifickej vlnovej dĺžke a emitujúca potrebnú intenzitu svetelného toku. Fluorochrómy pôsobí ako farbivá, ktoré môžu nezávisle na sebe spojených s konštrukciou (viditeľné alebo neviditeľné). Preto majú vysokú selektivitu k cieľu, a kvantový výťažok.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescenčné mikroskopia bol široko používaný od nástupu prírodných a syntetických farbív. Sú vlastnil niektorých profilov intenzita vyžarovania a excitáciu a zameraný na konkrétne biologickými materiálmi.

Identifikácia jednotlivých molekúl

Často, v ideálnych podmienkach, môžete sa zaregistrovať samostatný prvok žiara. Za týmto účelom, okrem iného, že je potrebné zabezpečiť dostatočne nízka hlučnosť detektora a optické pozadia. Fluorescein molekula k neúspechu kvôli fotovybělení môže emitovať až 300 tisíc. Fotónov. Pri 20% účinnosti zachytávania procesu a môže registrovať v množstve asi 60 tis.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescenčné mikroskopia založené na lavínové fotodiódy alebo elektronickej násobenie, umožnil vedcom sledovať správanie jednotlivých molekúl cez druhého, a v niektorých prípadoch dokonca minút.

zložitosť

Kľúčovou otázkou v prospech potlačenie optického šumu pozadia. Vzhľadom k tomu, že mnoho z materiálov použitých pri konštrukcii filtrov a šošoviek vykazujú určitú autofluorescence, úsilie vedcov v počiatočných fázach boli orientované na výrobu súčastí, ktoré majú nízku fluorescenciu. Avšak, následné pokusy viedli k novým záverom. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Predovšetkým sa zistilo, že fluorescenčné mikroskopia, na základe úplného vnútorného odrazu, to umožňuje, aby sa dosiahlo nízke pozadie a vysokou intenzitou excitačného svetla.

mechanizmus

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Princípy fluorescenčné mikroskopia, na základe úplného vnútorného odrazu je použitie evanescentním vĺn alebo pominuteľný. To nastane na hranici medzi médiami s rôznymi indexmi lomu. V tomto prípade je svetelný lúč prechádza hranolom. Má vysoký parameter indexu lomu.

Hranol priľahlé k vodného roztoku alebo skla s nízkym parametrom. Ak sa lúč svetla smerovaného na ňu v uhle, ktorý je viac kritický, je lúč úplne odráža od rozhrania. Tento jav, podľa poradia, spôsobí nonpropagating vlny. Inými slovami, generované elektromagnetické pole, ktoré preniká do média s nižším parameter indexu lomu na vzdialenosť menšiu ako 200 nanometrov.

Exponenciálne zanikajúcej vlna Intenzita svetla by bol dostatočný na excitáciu fluorofor. Avšak, vzhľadom k jeho veľmi malej hĺbke, jej objem bude veľmi malý. Výsledkom je low-level pozadia a.

modifikácie

Fluorescenčné mikroskopia je založená na celkovej vnútornej reflexiu, môže byť vykonávaná s epi-osvetlenie. To si vyžaduje šošovky s vysokou číselnou apertúrou (aspoň 1,4, ale je žiaduce, aby sa dosiahlo 1,45-1,6), a čiastočne osvetlené pole zariadení. Tá sa dosahuje s malou veľkosťou bodu. Pre väčšie jednotnosti tenkým kruh, ktorý je blokovaný prostredníctvom časťou prúdu. Za kritický uhol, po ktorej dochádza k úplnému odrazu, potrebujeme vysokú úroveň lomu ponorné média v objektíve a krycím skle mikroskopu.