Molekulárna spôsob genetický výskum

Preskúmať a identifikovať varianty, v štruktúre DNA, použité molekulárne genetické metódy. Pre každú oblasť DNA, ktorá skúma túto oblasť chromozómu, gén alebo alely, metódy sa líšia. Ktorý je základom každého molekulárne genetické metódy zahŕňa niektoré alebo inú manipuláciu s RNA a DNA. Všetky tieto metódy sa vyznačujú obrovskou zložitosťou bez toho laboratórne podmienky nemôžu byť vykonané, a zamestnanci musia byť vysoko kvalifikovaní. Táto práca sa vykonáva v niekoľkých stupňoch.

stupňa

Po prvé, RNA alebo DNA vzorky, ktoré majú byť vyrobené. Tu je molekulárne genetickej metóda môže byť použitá prakticky akéhokoľvek materiálu: kvapku krvi, leukocyty, fibroblasty kultúry, sliznice (lúpaný), dokonca aj vlasové folikuly, - DNA môže byť získaná z akéhokoľvek vzorky. Je vhodné použiť akékoľvek molekulárne genetických metód a ich rôzne varianty a už dlho izolovaná DNA sa uloží v zmrazenom stave. Druhý stupeň je určený pre hromadenie požadovaných fragmentov (amplifikácie DNA), pretože pomáha zaistiť polymerázovej reťazovej reakcie in vitro (in vitro bez zapojenia živý organizmus). Výsledkom je, že vybraný fragment DNA násobí tejto reťazovej a vzrastie množstvo DNA doslova miliónkrát.

Tretím krokom v molekulárne genetickej výskumu sa predpokladá, vynásobený obmedzenia DNA (tento fragmentácii, trhanie alebo rezanie). Obmedzenie vykonáva elektroforézou na polyakrylamidovom alebo agarózovom gélu. Táto molekulárne genetická metóda štúdia DNA fragment umožňuje každému, aby sa určité pozície v gélu. Potom sa gél sa spracuje s etidiumbromidom, ktorý je schopný viazať sa na DNA, ožarovanie ultrafialovým svetlom, potom je možné pozorovať luminiscenčné časti. Molekulárne genetické diagnostické metódy sú rôzne a početné, ale prvé dva kroky sú spoločné pre všetky. Aby však bolo možné identifikovať fragmenty DNA, gél môže byť farebné, a mnoho iných existujúcich metód.

druh

Medzi priame a rozšírené metódy na detekciu mykobaktérií môže obsahovať vyššie uvedené metódy molekulárnej genetickú DNA učenia. Jeho podstatou je to, že za účelom identifikácie materiálu skenovanie reťazca špecifických fragmentov DNA patogénov. Molekulárne genetické diagnostické postupy doteraz nemajú efektívnejší spôsob rozpoznať takýchto ochorení je tuberkulóza. Pomocou PCR (PCR), môže si byť istý, že pôvodný DNA sa zvýši počet kópií v miliónkrát, to znamená, že dôjde k zosilneniu, a zobrazí výsledky. Úroveň citlivosti je veľmi vysoká - viac ako deväťdesiat päť percent, čo je hlavnou výhodou tohto spôsobu.

Zvyšok molekulárne-genetických metód výskumu o účinnosti výťažku viac kópií doslova zdvojnásobil, pretože v tomto prípade vypracovania vzorka vykazuje špecifickú oligonukleotidové sekvenciu zvýši na sto šesťkrát. Dokonca aj kultúra diagnózu tuberkulózy dýchacieho ústrojenstva výrazne znížiť jeho citlivosť. To je dôvod, prečo sa moderná medicína vychádza z molekulárne genetických metód diagnostiky tuberkulózy. Popisovanú metóda je účinná predovšetkým pri rokovaní s patogénmi vysokou antigénne variabilitou, zistiť, že iný spôsob, ako je oveľa ťažšie - vyžaduje osobitnú živná média a kultivujú dlhú dobu. Biochemické a molekulárne genetické metódy produkujú veľmi odlišný vplyv na výsledky.

diagnóza tuberkulózy

Marshall PCR diagnostiku tuberkulózy najčastejšie pomocou týchto sekvencií DNA, ktoré sú špecifické pre všetky štyri typy ochorenia. Na dosiahnutie tohto cieľa sa často používajú priméry, ktoré detekujú sekvencie je prvkov (IS-986, IS-6110), pričom tieto prvky charakterizujú vysoko migrujúce druhy Mycobacterium tuberculosis a vždy k dispozícii viac kópií v genóme. Tiež extrakcie DNA sa môže vykonávať z čistých kultúr a klinické (spúte) ktorýmkoľvek iným vhodným spôsobom. Napríklad, tam, kde spôsob Boom lyzačný pufor sa používa na základe Tiokyanatan guanidínu a oxidu kremičitého ako nosiča DNA. Počet pacientov, ktoré sa líšia zlou bakteriologických zvyšuje každý rok, a preto sa v klinickej praxi zaviedol úplne odlišnú úroveň organizácie: molekulárno-genetická metóda štúdia DNA hrá významnú úlohu v diagnostike.

Musíme však uznať, že to nie je bez nedostatkov. Metóda PCR je použitie často prináša obrovské množstvo falošne pozitívnych výsledkov, a dôvodom je nielen technické chyby, ale tiež vlastnosti samotného spôsobu. Navyše, pomocou tejto metódy diagnostiky pre stanovenie životaschopnosti mykobaktérií, ktoré boli identifikované, je jednoducho nemožné. Ale táto nevýhoda nie je najdôležitejšia. Molekulárne genetickej metódy diagnostiky PCR so sebou nesú riziko kontaminácie mykobakteriálne DNA. Požiadavky na osvedčenie pre tento dôvod, že pre PCR laboratóriá určené výhradne tvrdo, oni vyžadujú tri oddelené priestory. PCR technológia je moderný a veľmi zložité, vyžaduje použitie vhodného zariadenia a vysoko vyškolený personál.

bacterioscopy

Ak výsledky diagnostiky analýzy musí byť v porovnaní s inými dátami: klinické vyšetrenie, rádiografia, steru mikroskopie, plodiny a dokonca aj ako odpoveď na špecifické liečby sú veľmi dôležité. V tejto sérii, štúdie PCR je iba jedna zo zložiek. Detekcia patogénu v skorej diagnostike môžu byť najjednoduchší a najrýchlejší metódy - bakteriologické.

Tu sa používa svetelného mikroskopu (sfarbenie Ziehl-Neelsen) a fluorescenčné farbivá (fluorochrómy). Výhodou je rýchlosť ster výsledky. Ale jeho nevýhodou je právom považovaný obmedzená kapacita vzhľadom k nízkej citlivosti. Avšak, táto metóda je vzhľadom k odporúčaní Svetovej zdravotníckej organizácie ako najekonomickejšie a krajiny odhaliť pacientov tuberkulózy. Detekcia mykobaktérií bakteriologickou metódou má hodnotu predikcie a odhadovanú kvantitatívne bakteriálne vylučovanie. Oveľa väčšiu istotu sa s tým molekulárne genetických metód výskumu tuberkulózy.

kultúry

Lepšie detekcie mykobaktérií rozpoznať kultúrnych štúdií. Výsev patologické materiálu je vyrobená do vaječnej média: Mordovskej, Finn II, LJ, a podobne. Porovnávacie testy rezistencie mykobaktérií na lieky a nepriame dôkazy o účinnosti radu mykobaktérií a ich kolónie in vitro, ak použité metódy výskumu kultúry. Zvýšiť percento izolácie mykobaktérií očkovanie patologického materiálu sa koná na rôznych prostrediach.

Uspokojovanie potrieb početné kultúrne, patogénov, vrátane dotácie a tekutín. Používaný v tomto systéme a automatizované typ merania rastu VANTES. Plodiny sa musia konať v inkubácii po dobu až siedmich až ôsmich týždňov. Do tejto doby sa plodina s nedostatkom rastu možno považovať za negatívne. Najúčinnejší spôsob pre detekciu Mycobacterium tuberculosis do úvahy biologické vzorky: diagnostické materiál infikovať morčatá, ktoré sú mimoriadne citlivé na TB.

niektoré čísla

Zaujímavé odbor, ktorý bol otvorený diagnostikou PCR bolo štúdium M. tuberculosis - latentnej infekcii. Moderné poňatie nákazy TBC naznačuje, že zo sto ľudí, ktorí boli v kontakte s M. tuberculosis, deväťdesiat môže dobre byť infikovaný, ale iba desať z nich sú aktívne ochorenie je vyvíjaný. Iní majú TB imunitu, a preto, že deväťdesiat percent prípadov infekcie zostáva latentný. Detekcia vzoru to pomohlo molekulárne genetické metódy.

Genetici hovoria, že päťdesiat päť percent z tých, ktorých plodiny patologický materiál boli negatívne, a osemdesiat percent ľudí infikovaných M. tuberculosis, ale prúdi bez rádiografického prejavy ochorenia, PCR pozitívne reakcie dostal. Je to genetická diagnostická metóda pomohla k identifikácii pacientov s rizikom PCR štúdiách s výsledkami ich analýz (mikroskopie a kultúra) boli negatívne, a subklinického infekcie M. tuberculosis bol prítomný.

moderný výskum

Ruská federácia a bakteriologické laboratóriá použiť zrýchlenou metódou absolútnych koncentrácií: nitrátreduktasu aktivity testovaných Griessova činidlá mykobaktérií. Anti-TB centier použiť spôsob, ktorý umožní určiť liekovú rezistenciu. Toto očkovanie v kvapalnom médiu, kde automated rádiometrické a fluorescenčné účtovný systém rast mykobaktérií. Takáto analýza sa robí rýchlo - až dva týždne.

V súčasnej dobe, nové metódy sú vyvíjané: rezistencie mykobaktérií sa meria na úrovni genotypu. Štúdium molekulárnych mechanizmov génov rezistencie a ukazuje na prítomnosť v mykobaktérií. Tieto gény sú spojené s rezistenciou voči niektorých liekov. Napríklad gény Kasa, inhA, katG odolný voči izoniazidu, rpoB génu - rifampicín RNA génov 16SP a rpsL - streptomycín, emb1 - na ethambutol, Gyra - fluorochinolón, a tak ďalej.

mutácie

Moderné diagnóza výrazne zvýšila metódy molekulárnej genetickej úrovni pre štúdium DNA a nechá sa vykonávať rozsiahle štúdie mutácií v celej ich spektrum. Teraz vieme, že najbežnejšie mutácie v 516, 526 a 531 kodónov génu rpoB, a identifikovali odolnosť proti rôznym lieky. K dispozícii je celý rad metód pre písanie mykobaktérií za použitia nielen tradičné metódy - biochemické, biologické a kultúrne, ale aj široko používané moderné molekulárne genetických metód. Už existujú dostatočné a poskytujú správny spôsob diagnózy pre detekciu monogenní ochorenia. Sú založené na štúdiu DNA v presnej oblasti určitého génu. Toto je zvyčajne komplexný proces, časovo náročné a nákladné, ale dáta, ktorá je poskytovaná molekulárne genetickej analýzy, je oveľa presnejší a informatívne než dáta všetkých ostatných analýz.

Je už dlho známe, že DNA sa nemení po celú dobu životnosti organizmu, že je v každom jadrových buniek odnakova, a to umožňuje, aby sa na analýzu úplne všetkých bunkách tela, v akejkoľvek fáze ontogenézy. Poškodený gén môže byť detekovaná pred objavením sa prvých príznakov do klinického ochorenia full-scale, rovnako ako u zdravých heterozygotná ľudí, ale majú mutáciu v géne. Molekulárne genetické dedičné ochorenie diagnostické metódy umožňujú odhaliť jeho (priamy prístup, DNA diagnostiku), ako aj pre analýzu segregáciu ochorenie v rodine s markerom loci DNA (genetických polymorfizmov), ktoré sú úzko spojené s poškodeným génom (tj nepriamy prístup DNA diagnostika). Priamo alebo nepriamo - akékoľvek DNA diagnostika je založená na metódach identifikácie presne definovanú časť ľudskej DNA.

priame metódy

Priame metódy DNA diagnostiky, sú, ak je dedičné ochorenie vinník gén známy, ako dobre známe, a typy jeho mutácií. Napríklad sa môžu použiť vhodné priame metódy v rade chorôb. Táto Huntingtonova chorea (predlžovacie CTG-repetície), fenylketonúria (R408W), cystická fibróza (delF508, hlavný mutácie) a podobne. Hlavnou výhodou priame metódy je úplne vo vlastníctve diagnostickú presnosť, a nie je potrebné vykonať analýzu DNA zvyšku rodiny. Ak je nájdená mutácia v zodpovedajúceho génu, umožňuje presne schváliť diagnózu dedičnosti, stanovenie genotypu pre zvyšok zaťaženého rodiny.

Ďalšia výhoda priame diagnózy je považovaná za identifikáciu heterozygotná nosič zlých mutácií od príbuzných a rodičov, ktorí zomreli na túto chorobu. To platí najmä u chorôb autozomálne recesívne. Nevýhody priame metódy sú k dispozícii tiež. Aplikovať je, čo potrebujete vedieť presne lokalizovať abnormálne gén, exon-intronom štruktúru svojej spektra a jeho mutácie. Nie všetky monogenní choroby dnes dostali tieto informácie. Spravodajskej hodnoty priame metódy nemožno považovať za úplný, pretože jeden a ten istý gén môže mať veľký počet patologických mutácií, ktorá spôsobuje rozvoj dedičných chorôb.

nepriamej metódy

Nepriame metódy v diagnostike DNA sú použité vôbec, v ostatných prípadoch, ak je k poškodeniu génov, ktoré nie sú uvedené, ale iba chromozomálne, alebo v prípade, že diagnóza línia nedal výsledok (to stane, ak je gén komplexu molekulárnej organizácie alebo veľkého rozsahu, ak existuje veľa patologickej mutácie). Nepriame metódy vykonávané Analýza oddeľovanie polymorfných markerov v alelické rodine. Markery nájdené v rovnakej chromozomálnej oblasti alebo miesto, úzko súvisí s chorobou a predstavujú delécie alebo inzercie, bod substitúcia, opakovanie, a ich polymorfizmus je kvôli odlišnej množstvo buniek v bloku.

Najvhodnejšie pre nepriame diagnózu považovaná mikrosatelitov a minisatellite polymorfizmov, ktoré sú široko distribuované v ľudskom genóme. ich hodnota vyjadrená v vysokým obsahom informácií, ak je k poškodeniu genetickej vzdialenosti medzi markerom a génom, nie je príliš veľký. V poslednom prípade sa presnosť odhadu je určená do značnej miery frekvencie rekombinácie medzi polymorfným markerom a poškodenia. Nepriame diagnostické metódy tiež povinné predbežný krok allele frekvenciami analyzovaného populačné štúdie u pacientov a nosičov mutácií, plus nutnosť určenie pravdepodobnosti rekombinácie nerovnovážnej a adhéznych markerov a mutantných alel.

iné metódy

Krátke úseky RNA alebo DNA, rovnako ako jediný gén vizualizované pod mikroskopickú štúdii nemôže byť preto na identifikáciu mutácií potrebnej molekulárne genetická diagnostika. Tam je "Human Genome Project", ako aj ďalšie pokroky v molekulárnej genetike veľmi rozšíril možnosti diagnostiky dedičných chorôb - a to ako pred a postnatálnu. Tieto metódy môžu zabezpečiť včasné odhalenie a robiť predikcie polynenasýtené a monogenní ochorenie, ktorého debut sa koná v dospelosti. Bohužiaľ, vzhľadom k technickým možnostiam molekulárne genetických štúdií, ktoré sa niekedy nad rámec etických limity, ktoré sú stanovené vo vzťahu k dedičstva, najmä pri stanovení diagnózy je v dospievaní a detstve.

Štrukturálne a kvantitatívne anomálie chromozómov sú najčastejšími príčinami onkologických ochorení a mnohých vývojových anomálií. Mali by sa určiť chromozomálne aberácie, ktoré sú dôležité pre rodinné poradenstvo - zhodnotiť prognózu spolu s reprodukčným rizikom v budúcich tehotenstvách. Chromozomálna analýza je "zlatým štandardom" genetickej diagnostiky, ale má aj obmedzené možnosti. Len metódy molekulárnej genetickej analýzy môžu robiť viac, pretože používajú fluorescenčné značky založené na klonovacích technológiách, ktoré dokážu s vysokou citlivosťou odhaliť jemné chromozomálne zmeny, ktoré nedokážu detegovať klasický cytogenetický výskum. Tieto techniky čoraz viac rozširujú naše diagnostické schopnosti, keď sa skúmajú deti s vývojovými poruchami, s mentálnou retardáciou a mnohými inými dedičnými ochoreniami.

zistenie

Veľmi dôležitá pre ľudstvo bola znalosť štruktúry a funkcií génov, typy ich variability, schopnosť rozpoznať dedičné choroby, ktoré sa vyskytli v súvislosti s vývojom molekulárnej genetiky. Jeho metódy sú zamerané na štúdium molekuly DNA - a keď je to normálne a ak je poškodená. Príprava nukleotidových sekvencií deoxyribonukleovej kyseliny (DNA) prebieha postupne od prípravy vzoriek až po identifikáciu jednotlivých fragmentov. Izolácia genómovej DNA z buniek, obmedzenie (roztrhnutie), amplifikácia (klonovanie), elektroforéza fragmentov (separácia elektrickým nábojom a molekulová hmotnosť pomocou agarózového gélu). Identifikácia určitých fragmentov umiestnených na jeho povrchu pomocou diskrétneho pásu.

Potom sa do prípadu vkladajú špeciálne filtre, pomocou ktorých sa hybridizuje každý fragment s klonovanými fragmentmi DNA alebo kontrolnými syntetickými rádioaktívnymi sondami, pomocou ktorých sa každý hybridizovaný fragment bude skúmať. Ak sa pozícia alebo jej dĺžka zmenia vzhľadom na sondu, ak sa objaví alebo zmizne nový fragment, to všetko naznačuje, že študovaný gén prešiel preskupením v nukleotidovej sekvencii. Existuje osem základných metód molekulárneho genetického výskumu: sekvenovanie (stanovenie sekvencie DNA), polymerázová reťazová reakcia (zvyšovanie počtu sekvencií), získanie primérov známych génov, klonovanie DNA, získanie rekombinantných molekúl, získanie proteínov prostredníctvom rekombinantných molekúl, Library) klonovaných fragmentov, ktoré boli získané obmedzením.